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# 易宏基因组软件和数据库 EasyMetagenome software & database
# 版本Version: 1.20, 2023/11/23
# 操作系统Operation System: Linux Ubuntu 22.04+ / CentOS 8+
# 主页Homepage: https://github.com/YongxinLiu/EasyMetagenome
所有软件和数据库可从官网下载，All software and databases can be downloaded from the official website, 备选 optional：
中科院微生物所Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences：ftp://download.nmdc.cn/tools/ (FileZilla访问)
百度网盘Baidu Netdisk：https://pan.baidu.com/s/1Ikd_47HHODOqC3Rcx6eJ6Q?pwd=0315
# 一、数据预处理 Data preprocessing
## 初始化：每次开始安装必须运行下面代码 Initialization: The following code must be run every time when installation starts
安装前准备：软件和数据库位置 Before Installation: Software and Database Locations
# 数据库安装位置Database Locations，默认~/db目录(无需管理权限)，管理员可选/db
db=~/db
mkdir -p ${db} && cd ${db}
# 软件安装位置Software installation location，默认为~/miniconda3，测试服务器为/anaconda3
soft=~/miniconda3
# 经常使用的服务器环境，可把全文${db}和${soft}替换为绝对路径，将不再需要每次读取以上环境变量
# In the frequently used server environment, you can replace the variable ${db} and ${soft} with absolute paths, and you will no longer need to run the above environment variables every time
# 可选：初始化环境变量，可能提高软件安装成功率
# Optional: Initialize environment variables, which may improve the success rate of software installation
PATH=${soft}/bin:${soft}/condabin:/usr/local/sbin:/usr/local/bin:/usr/sbin:/usr/bin:/sbin:/bin:${db}/EasyMicrobiome/linux:${db}/EasyMicrobiome/script
echo $PATH
### EasyMetagenome流程Pipeline
EasyMetagenome流程，包括流程安装、使用和可视化脚本，以及流程测试数据和结果正对照，网址：https://github.com/YongxinLiu/EasyMetagenome
三种下载方法：依赖尝试/任选其一至成功即可
# 方法1. 网页 https://github.com/YongxinLiu/EasyMetagenome 中Code - Download ZIP下载压缩包，上传至服务器
# 解压，Command 'unzip' not found使用sudo apt install unzip安装
unzip EasyMetagenome-master.zip
# 改名
mv EasyMetagenome-master EasyMetagenome
# 方法2. 微生物所备用链接，可能不是最新版
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/soft/EasyMetagenome.tar.gz
tar xvzf EasyMetagenome.tar.gz
# 方法3. git下载，需安装git
git clone https://github.com/YongxinLiu/EasyMetagenome
# 旧版更新
cd EasyMetagenome && git pull && cd ../
### EasyMicrobiome软件和数据库合集dependencies
EasyMetagenome依赖EasyMicrobiome，其包括众多脚本、软件和数据库的集合，网址：https://github.com/YongxinLiu/EasyMicrobiome
# 方法1. 网页中下载
# https://github.com/YongxinLiu/EasyMicrobiome 中Code Download ZIP下载压缩包，上传至服务器，并解压
unzip EasyMicrobiome-master.zip
mv EasyMicrobiome-master EasyMicrobiome
# 方法2. 备用链接下载
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/soft/EasyMicrobiome.tar.gz
tar -xvzf EasyMicrobiome.tar.gz
# 方法3. git下载，需安装git
git clone https://github.com/YongxinLiu/EasyMicrobiome
# 旧版更新
cd EasyMicrobiome && git pull && cd ../
# 软件安装
# 添加linux命令可执行权限
chmod +x `pwd`/EasyMicrobiome/linux/* `pwd`/EasyMicrobiome/script/*
# 添加环境变量
echo "export PATH=\"\$PATH:`pwd`/EasyMicrobiome/linux:`pwd`/EasyMicrobiome/script\"" >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc
echo $PATH
### 软件管理器Conda
# 下载最新版miniconda3，70M
wget -c https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
# 安装，-b批量，-f无提示，-p目录，许可协议打yes
bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh -b -f -p ${soft}
# 激活，然后关闭终端重开，提示符前出现(base)即成功
${soft}/condabin/conda init
source ~/.bashrc
# 查看版本，conda 23.7.3, python 3.11.4
conda -V
python --version
# 添加常用频道
conda config --add channels bioconda # 生物软件
conda config --add channels conda-forge # Highest priority
# conda默认配置文件为 ~/.condarc 查看配置文件位置
conda install mamba -c conda-forge -y
mamba install pandas -c conda-forge -y
mamba install conda-pack -c conda-forge -y
conda config --set channel_priority strict
conda config --show-sources
# 查看虚拟环境列表
conda env list
更多conda中文安装使用教程参考：[Nature Method：Bioconda解决生物软件安装的烦恼](https://mp.weixin.qq.com/s/SzJswztVB9rHVh3Ak7jpfA)
[一文掌握Conda软件安装：虚拟环境、软件通道、加速solving、跨服务器迁移](https://mp.weixin.qq.com/s/tKAU09_w7Cu7khA9M2EGEQ)
## 质控Quality control: kneaddata/fstqc/multiqc/fastp
**注：直接安装、下载解压安装，二选一。一种方法不成功，尝试另一种。**
BioConda: https://bioconda.github.io/recipes/kneaddata/README.html
### 方法1.kneaddata直接安装
# 新建kneaddata环境
conda create -y -n kneaddata
conda activate kneaddata
# fastqc质量评估，multiqc评估报告汇总，kneaddata质量控制流程，fastp质控工具
mamba install kneaddata fastqc multiqc fastp r-reshape2 -y
### 方法2.kneaddata下载解压安装
# 指定conda文件名
s=kneaddata
# 下载，可选NMDC、百度云等
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/conda/${s}.tar.gz
# 指定安装目录
mkdir -p ${soft}/envs/${s}
tar -xvzf ${s}.tar.gz -C ${soft}/envs/${s}
# 启动环境
conda activate ${s}
# 初始化环境
conda unpack
### kneaddata安装测试
fastqc -v # v0.12.1
kneaddata --version # 0.12.0
trimmomatic -version # 0.39
bowtie2 --version # 2.5.1
multiqc --version # 1.15
# (可选)安装软件打包，f覆盖输出文件，ignore跳过修改检测
n=kneaddata
conda pack -f --ignore-missing-files -n ${n} -o ${n}.tar.gz
### kneaddata数据库下载
# 查看可用数据库
kneaddata_database
# 包括人基因组bowtie2/bmtagger、人类转录组、核糖体RNA和小鼠基因组
# 下载人基因组bowtie2索引 3.44 GB
mkdir -p ${db}/kneaddata/human
kneaddata_database --download human_genome bowtie2 ${db}/kneaddata/human
# 备用链接下载人类基因组至上述目录，并解压
cd ${db}/kneaddata/human
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/meta/kneaddata/human_genome/Homo_sapiens_hg37_and_human_contamination_Bowtie2_v0.1.tar.gz
tar xvzf Homo_sapiens_hg37_and_human_contamination_Bowtie2_v0.1.tar.gz
# 下载小鼠基因组bowtie2索引 2.83 GB
mkdir -p ${db}/kneaddata/mouse
kneaddata_database --download mouse_C57BL bowtie2 ${db}/kneaddata/mouse
# 备用手动下载
cd ${db}/kneaddata/mouse
wget -c http://huttenhower.sph.harvard.edu/kneadData_databases/mouse_C57BL_6NJ_Bowtie2_v0.1.tar.gz
tar xvzf mouse_C57BL_6NJ_Bowtie2_v0.1.tar.gz
### kneaddata自定义参考基因组索引
**(任何构建好的 bowtie2 索引都可，放置位置不限；如果有多个宿主，可以把多个宿主参考基因组序列合并后构建索引)**
自定义基因组构建索引，大多数基因组可在ensembl genome下载。此处以拟南芥为例，访问 http://plants.ensembl.org/index.html ，选择Arabidopsis thaliana —— Download DNA sequence (FASTA)，选择toplevel右键复制链接，填入下面链接处
# 创建子目录
mkdir -p ${db}/kneaddata/ath
cd ${db}/kneaddata/ath
# 下载
wget -c http://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-51/fasta/arabidopsis_thaliana/dna/Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa.gz
mv Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa.gz tair10.fa.gz
# wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/meta/kneaddata/tair10.fa.gz
# 解压
gunzip tair10.fa.gz
# bowtiew建索引，输入文件，输出文件前缀，4线程2分
bowtie2-build -f tair10.fa tair10 --threads 4
# 二、基于读长分析 Read-based (HUMAnN3/Kraken2)
## 宏基因组基于读长的分析 HUMAnN3/MetaPhlAn4/GraPhlAn
HUMAnN3+MetaPhlAn4为目前最新版，目前最广泛使用的HUMAnN2安装见附录
### HUMAnN3直接安装
# 安装HUMAnN3.7+MetaPhlAn4
conda create -n humann3
conda activate humann3
conda install humann=3.7 -c bioconda -c conda-forge
# 打包(可选)
conda pack -f -n humann3 -o humann3.tar.gz
### HUMAnN3解包安装
# 下载
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/conda/humann3.tar.gz
# 指定安装目录
mkdir -p ${soft}/envs/humann3
tar -xvzf humann3.tar.gz -C ${soft}/envs/humann3
# 启动环境
conda activate humann3
# 初始化环境
conda unpack
### HUMAnN3安装测试
# 记录核心软件版本
humann --version # v3.7
metaphlan -v # 4.0.6 (1 Mar 2023)
diamond help | head -n 1 # v2.1.8.162
# 测试
humann_test
### HUMAnN3物种和功能数据库
# 显示可用分类、泛基因组和功能数据库
humann_databases
# 安装数据库
cd ${db}
mkdir -p ${db}/humann3 # 建立下载目录
# 微生物泛基因组 16 GB
humann_databases --download chocophlan full ${db}/humann3
# 功能基因diamond索引 20 GB
humann_databases --download uniref uniref90_diamond ${db}/humann3
# 输助比对数据库 2.6 GB
humann_databases --download utility_mapping full ${db}/humann3
# humann3数据库无法自动下载，备用链接下载安装
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/meta/humann3/full_chocophlan.v201901_v31.tar.gz
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/meta/humann3/uniref90_annotated_v201901b_full.tar.gz
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/meta/humann3/full_mapping_v201901b.tar.gz
# 安装、解压
mkdir -p ${db}/humann3/chocophlan
tar xvzf full_chocophlan.v201901_v31.tar.gz -C ${db}/humann3/chocophlan
mkdir -p ${db}/humann3/uniref
tar xvzf uniref90_annotated_v201901b_full.tar.gz -C ${db}/humann3/uniref
mkdir -p ${db}/humann3/utility_mapping
tar xvzf full_mapping_v201901b.tar.gz -C ${db}/humann3/utility_mapping
# 设置数据库位置
# 显示参数
humann_config --print
# 如修改线程数，推荐3-8，根据实际情况调整
humann_config --update run_modes threads 8
# 设置核酸、蛋白和注释库位置
humann_config --update database_folders nucleotide ${db}/humann3/chocophlan
humann_config --update database_folders protein ${db}/humann3/uniref
humann_config --update database_folders utility_mapping ${db}/humann3/utility_mapping
# 核对设置结果
humann_config --print
### MetaPhlAn4物种数据库
# MetaPhlAn4数据库下载2022数据和索引3G+20G
mkdir -p ${db}/metaphlan4
cd ${db}/metaphlan4
# 官网下载
wget -c http://cmprod1.cibio.unitn.it/biobakery4/metaphlan_databases/mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212.tar
wget -c http://cmprod1.cibio.unitn.it/biobakery4/metaphlan_databases/bowtie2_indexes/mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212_bt2.tar
tar xvf mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212.tar
tar xvf mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212_bt2.tar
# 官方没有压缩体积大下载慢，备用国内百度链接：https://pan.baidu.com/s/1Ikd_47HHODOqC3Rcx6eJ6Q?pwd=0315 或 微生物所FTP ftp://download.nmdc.cn/tools/meta 下载压缩包
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/meta/metaphlan4/mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212.tar.gz
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/meta/metaphlan4/mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212_bt2.tar.gz
tar xvzf mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212.tar.gz
tar xvzf mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212_bt2.tar.gz
# 可选(制作下载文件和md5值)
gunzip mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212_bt2.tar.gz
md5sum mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212_bt2.tar > mpa_vOct22_CHOCOPhlAnSGB_202212_bt2.md5
## 生物标记鉴定和可视化LEfSe
方法1. 在线ImageGP http://www.bic.ac.cn/ImageGP/ 选择左侧LEfSe
方法2. 下载conda预安装包解压
n=lefse
# 下载
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/conda/${n}.tar.gz
# 指定安装目录
mkdir -p ${soft}/envs/${n}
tar -xvzf ${n}.tar.gz -C ${soft}/envs/${n}
# 启动环境
conda activate ${n}
# 初始化环境
conda unpack
方法3. 直接安装：经常无法安装，安装的代码也有可能存在问题
mamba create -n lefse lefse -c bioconda -y
## 物种注释Kraken2/bracken/krakentools/krona
kraken2 基于LCA算法的物种注释 https://ccb.jhu.edu/software/kraken/
Kraken2解包安装
# 下载
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/conda/kraken2.tar.gz
# 指定安装目录
mkdir -p ${soft}/envs/kraken2
tar -xvzf kraken2.tar.gz -C ${soft}/envs/kraken2
# 启动环境
conda activate kraken2
# 初始化环境
conda unpack
Kraken2直接安装，居然只安了2.0.7
mamba create -n kraken2 -y -c bioconda kraken2 bracken krakentools krona r-optparse
记录软件版本
kraken2 --version # 2.1.2
### Kraken2数据库安装
下载数据库(NCBI每2周更新一次)，记录下载日期和大小。需根据服务器内存、使用目的选择合适方案。--standard标准模式下只下载5种**标准数据库：古菌archaea、细菌bacteria、人类human、载体UniVec_Core、病毒viral**。也可选直接下载作者构建的索引，还包括bracken的索引。链接：https://benlangmead.github.io/aws-indexes/k2 （10/9/2023版）。 注：中科院网络下载较快，家里和农科院较慢，有时新版会有错误，可以退回旧版
方案1. 下载标准+原生动物+真菌 16GB (PlusPF-16)
v=k2_pluspf_16gb_20231009
mkdir -p ~/db/kraken2/pluspf16g
cd ~/db/kraken2
wget -c https://genome-idx.s3.amazonaws.com/kraken/${v}.tar.gz
# 备用链接
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/meta/kraken2/${v}.tar.gz
tar xvzf ~/db/kraken2/${v}.tar.gz -C ~/db/kraken2/pluspf16g
方案2. 下载标准+原生动物+真菌 69GB (PlusPF)
v=k2_pluspf_20231009
mkdir -p ~/db/kraken2/pluspf
cd ~/db/kraken2
wget -c https://genome-idx.s3.amazonaws.com/kraken/${v}.tar.gz
# 备用链接
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/meta/kraken2/${v}.tar.gz
tar xvzf ~/db/kraken2/${v}.tar.gz -C ~/db/kraken2/pluspf
方案3. 下载标准+原生动物+真菌+植物完整库 144G (PlusPFP)
指定解压目录，包括时间和类型
v=k2_pluspfp_20231009
mkdir -p ~/db/kraken2/pluspfp
cd ~/db/kraken2
wget -c https://genome-idx.s3.amazonaws.com/kraken/${v}.tar.gz
tar xvzf ${db}/kraken2/${v}.tar.gz -C pluspfp
# 三、组装 Assemble-based
## 组装、注释和定量 megahit/spades/quast/cd-hit/emboss/salmon/prodigal
### megahit解包安装
# 下载
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools//conda/megahit.tar.gz
# 指定安装目录
mkdir -p ${soft}/envs/megahit
tar -xvzf megahit.tar.gz -C ${soft}/envs/megahit
# 启动环境
conda activate megahit
# 初始化环境
conda unpack
### megahit直接安装
mamba create -y -n megahit megahit spades quast cd-hit emboss salmon prodigal
conda activate megahit
### megahit安装后测试
megahit -v # MEGAHIT v1.2.9
metaspades.py -v # metaSPAdes v3.15.4
metaquast.py -v # MetaQUAST v5.0.2
cd-hit -v | grep version # CD-HIT v4.8.1
embossversion # EMBOSS v6.6
salmon -v # salmon v1.8
## 蛋白同源综合注释eggNOG
eggNOG http://eggnogdb.embl.de
### eggNOG解包安装
# 下载
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/conda/eggnog.tar.gz
# 指定安装目录
mkdir -p ${soft}/envs/eggnog
tar -xvzf eggnog.tar.gz -C ${soft}/envs/eggnog
# 启动环境
conda activate eggnog
# 初始化环境
conda unpack
### eggNOG直接安装
# 新建环境并进入
conda create -n eggnog -y
conda activate eggnog
# 安装eggnog比对工具emapper
conda install eggnog-mapper -y -c bioconda -c conda-forge
### eggNOG安装测试
emapper.py --version # 2.1.12
# Expected eggNOG DB version: 5.0.2 / Installed eggNOG DB version: 5.0.2 /
# Diamond version found: diamond version 2.0.15 / MMseqs2 version found: 13.45111
### eggNOG数据库安装
# 下载常用数据库，注意设置下载位置
mkdir -p ${db}/eggnog && cd ${db}/eggnog
# -y默认同意，-f强制下载，eggnog.db.gz 6.3G+4.9G，解压后48G
download_eggnog_data.py -y -f --data_dir ${db}/eggnog
# 百度或微生物所备用链接下载eggnog.tar.gz
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/meta/eggnog/eggnog.tar.gz
tar xvzf eggnog.tar.gz
# 查看版本时会显示默认数据位置
emapper.py --version # 2.1.12
# 链接至默认目录，注意按实际情况修改
ln -sf ${db}/eggnog ${soft}/envs/eggnog/lib/python3.9/site-packages/data/
# 复制数据至内存中加速比对
# cp eggnog.* /dev/shm
### 碳水化合物CAZy
dbCAN3 http://bcb.unl.edu/dbCAN2
# 创建数据库存放目录并进入
mkdir -p ${db}/dbcan3 && cd ${db}/dbcan3
# 下载序列和描述
wget -c https://bcb.unl.edu/dbCAN2/download/Databases/V12/CAZyDB.07262023.fa
wget -c https://bcb.unl.edu/dbCAN2/download/Databases/V12/CAZyDB.08062022.fam-activities.txt
# 提取基因家簇对应注释
grep -v '#' CAZyDB.08062022.fam-activities.txt | sed 's/ //'| \
sed '1 i CAZy\tDescription' > CAZy_description.txt
# 打包压缩
tar -cvzf CAZyDB.tar.gz CAZyDB.07262023.fa CAZyDB.08062022.fam-activities.txt CAZy_description.txt
# 备用数据库下载并解压(待上传)
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/meta/dbcan3/CAZyDB.tar.gz
tar xvzf CAZyDB.tar.gz
# diamond建索引，1G，11s
diamond --version # 2.1.8
time diamond makedb --in CAZyDB.07262023.fa --db CAZyDB
## 抗生素抗性基CARD/rgi
CARD官网：https://card.mcmaster.ca
RGI Github: https://github.com/arpcard/rgi
### rgi解包安装
# 下载
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/conda/rgi.tar.gz
# 指定安装目录
mkdir -p ${soft}/envs/rgi
tar -xvzf rgi.tar.gz -C ${soft}/envs/rgi
# 启动环境
conda activate rgi
# 初始化环境
conda unpack
### rgi直接安装
mamba create -y -n rgi6 rgi=6.0.3
conda activate rgi6
# (可选)打包，待上传
n=rgi6
conda pack -f --ignore-missing-files -n ${n} -o ${n}.tar.gz
### rgi版本和数据库部署
# 查看版本 6.0.3
rgi main -v
# 数据库部署
mkdir -p ${db}/card && cd ${db}/card
# 下载最新版数据库，3.8M (2023-10-2, 3.2.8)
wget -c https://card.mcmaster.ca/latest/data
# 解压后35M
tar -xvf data ./card.json
# 加载数据库
rgi load --card_json card.json
# 宏基因组分析扩展数据库和加载
rgi card_annotation -i card.json
mv card_database_v3.2.8_all.fasta card.fasta
rgi load -i card.json --card_annotation card.fasta
# 四、分箱挖掘单菌基因组Binning
## metawrap分箱binning
软件主页：https://github.com/bxlab/metaWRAP
### metawrap下载安装
# 下载
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/conda/metawrap.tar.gz
# 指定安装目录
mkdir -p ${soft}/envs/metawrap
tar -xvzf metawrap.tar.gz -C ${soft}/envs/metawrap
# 启动环境
conda activate metawrap
# 初始化环境
conda unpack
### metawrap conda安装
mamba create -y --name metawrap --channel ursky metawrap-mg=1.3.2
conda activate metawrap
### metawrap相关数据库
cd ${db}
CheckM用于Bin完整和污染估计和物种注释
mkdir -p checkm && cd checkm
# 下载文件275 MB，解压后1.4 GB
wget -c https://data.ace.uq.edu.au/public/CheckM_databases/checkm_data_2015_01_16.tar.gz
tar -xvf *.tar.gz
# 设置数据库位置，直接2次回车默认为当前位置
checkm data setRoot
NCBI核酸和物种信息(可选)
# 核酸
mkdir -p ${db}/NCBI/nt
(cd ${db}/NCBI/nt; wget -c ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nt.*.tar.gz)
(cd ${db}/NCBI/nt; for i in *.tar.gz; do tar xzf $i; done)
# 可能会出现个别库下载不完整的情况，删了重下，不要续传
# 物种信息，压缩文件45M，解压后351M
mkdir -p ${db}/NCBI/tax
(cd ${db}/NCBI/tax; wget -c ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/taxonomy/taxdump.tar.gz)
(cd ${db}/NCBI/tax; tar -xvzf taxdump.tar.gz)
## 数据库位置设置
which config-metawrap
# 配置文件通常为~/miniconda3/envs/metawrap/bin/config-metawrap
# 使用Rstudio/vim等文本编辑器来修改数据库的位置
# config-metawrap文件中内容如下
# Paths to metaWRAP scripts (dont have to modify)
mw_path=$(which metawrap)
bin_path=${mw_path%/*}
SOFT=${bin_path}/metawrap-scripts
PIPES=${bin_path}/metawrap-modules
# CONFIGURABLE PATHS FOR DATABASES (see 'Databases' section of metaWRAP README for details)
# path to kraken standard database
KRAKEN_DB=~/KRAKEN_DB
KRAKEN2_DB=~/db/kraken2/pluspf/
# path to indexed human (or other host) genome (see metaWRAP website for guide). This includes .bitmask and .srprism files
BMTAGGER_DB=~/BMTAGGER_DB
# paths to BLAST databases
BLASTDB=~/db/NCBI/nt
TAXDUMP=~/db/NCBI/tax
## drep基因组去冗余
挑单菌测序的基因组存在大量冗余。metawrap混合分箱的结果中冗余度非常低，甚至无冗余。而单样本、分批次分箱的结果中存在大量冗余，需要采用drep获得非冗余的基因组。
GitHub: https://github.com/MrOlm/drep
Conda: https://bioconda.github.io/recipes/drep/README.html
### drep 基因组去冗余解包安装
# 下载dRep v3.2.3无法安装依赖chechm，仍用旧版2.6.2(500M)，这个压缩包没有checkm且版本为3.4.2
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/conda/drep.tar.gz
# 指定安装目录
mkdir -p ${soft}/envs/drep
tar -xvzf drep.tar.gz -C ${soft}/envs/drep
# 启动环境
conda activate drep
# 初始化环境
conda unpack
dRep -h
### drep 基因组去冗余直接安装
# 2023/9/12尝试，仍无法安装checkm
mamba create -y -n drep drep=3.4.3
conda activate drep
# 不满足依赖关系
mamba install checkm-genome -y
dRep -h
### drep 数据库构建
CheckM用于Bin完整和污染估计和物种注释，安装过metawrap已经下载完成
mkdir -p ${db}/checkm && cd ${db}/checkm
# 下载文件275 MB，解压后1.4 GB
wget -c https://data.ace.uq.edu.au/public/CheckM_databases/checkm_data_2015_01_16.tar.gz
tar -xvf *.tar.gz
# 设置数据库位置，直接2次回车默认为当前位置
checkm data setRoot `pwd`
## coverm基因组定量
conda安装
conda create -n coverm -y
conda activate coverm
conda install coverm -c bioconda -y
# conda安装后打包(可选)
conda pack -f --ignore-missing-files -n coverm -o coverm.tar.gz
压缩包安装
# 指定conda文件名
s=coverm
# 下载，可选NMDC、百度云等
# wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/conda/${s}.tar.gz
# 指定安装目录
mkdir -p ~/miniconda3/envs/${s}
tar -xvzf ${s}.tar.gz -C ~/miniconda3/envs/${s}
# 启动环境
conda activate ${s}
# 初始化环境
conda unpack
## GTDB细菌基因组注释和进化分析
Github: https://github.com/Ecogenomics/GTDBTk
GTDB-Tk是一个软件工具包，用于根据基因组数据库分类法GTDB为细菌和古细菌基因组分配客观的分类法。它旨在与最近的进展一起使用，从而可以直接对环境样本中获得数百或数千个由宏基因组组装的基因组（MAG）进行物种分类注释。它也可以用于分离和单细胞的基因组物种注释。
本次测试版本为 gtdbtk-2.2.6，Release 07-RS207v2 (11th May 2022)。
硬件要求：内存200Gb，硬盘66Gb，64核1小时可分析1000个细菌基因组
### GTDB-Tk直接安装
# gtdbtk-2.3.2, 2023-7-8
n=gtdbtk2.3
mamba create -y -n ${n} -c conda-forge -c bioconda gtdbtk=2.3.2
# 检查版本
gtdbtk -v # 2.3.2
# conda pack软件打包一次
# --exclude gtdbtk-2.3.2 指定排除数据库
conda pack -n ${n} -o ${n}.tar.gz --exclude gtdbtk-2.3.2 --ignore-editable-packages --ignore-missing-files
chmod 755 *
### GTDB-Tk解包安装
soft=~/miniconda3
# 下载，目前为2.1，需更新为2.3
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/conda/gtdbtk.tar.gz
# 指定安装目录
mkdir -p ${soft}/envs/gtdbtk
tar -xvzf gtdbtk.tar.gz -C ${soft}/envs/gtdbtk
# 启动环境
conda activate gtdbtk
# 初始化环境
conda unpack
### GTDB-Tks数据库安装
download-db.sh自动下载数据库，将下载至conda中的envs/gtdbtk/share/gtdbtk-2.3.2/db/，我们修改为~/db/gtdb中
conda activate gtdbtk2.3
# download-db.sh中，修改数据库下载位置，的 wget 建议改成wget -c 防止覆盖
sed -i 's#miniconda3/envs/gtdbtk2.3/share/gtdbtk-2.3.2/db#db/gtdb2.3#;s/wget /wget -c /' ${soft}/envs/gtdbtk2.3/bin/download-db.sh
# 下载数据,78G
download-db.sh
(备选)下面无法下载时手动下载和配置GTDB数据库
mkdir -p ${db}/gtdb2.3 && cd ${db}/gtdb2.3
# 下载解压
wget -c https://data.gtdb.ecogenomic.org/releases/release214/214.0/auxillary_files/gtdbtk_r214_data.tar.gz
# 再运行, gtdb配置数据库
download-db.sh
# 备用链接和手工解压，指定安装完整路径
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/meta/gtdb/gtdbtk_r214_data.tar.gz
tar xvzf gtdbtk_r207_v2_data.tar.gz -C ./ --strip 1
conda env config vars set GTDBTK_DATA_PATH="/data/meta/db/gtdb/"
# 5 单菌基因组、病毒组等其他软件
## CheckM2
Conda主页：https://bioconda.github.io/recipes/checkm2/README.html
软件主页：https://github.com/chklovski/CheckM2
# 软件安装
mamba create --name checkm2 checkm2
conda activate checkm2
checkm2 -h # CheckM2 v1.0.1
# 数据库安装
mkdir ~/db/checkm2
checkm2 database --download --path ~/db/checkm2
# 报错：checkm2.zenodo_backpack.ZenodoConnectionException: Connection error: HTTPSConnectionPool(host='zenodo.org', port=443): Max retries exceeded with url: /record/5571251 (Caused by NewConnectionError('<urllib3.connection.HTTPSConnection object at 0x7f335c64abe0>: Failed to establish a new connection: [Errno 111] Connection refused'))
# 在github中搜索和查找issues无解答，提新issue https://github.com/chklovski/CheckM2/issues
# 数据库 https://zenodo.org/records/5571251 下载，需要VPN
export CHECKM2DB="path/to/database"
# 测试
checkm2 testrun
# 运行，输入目录或文件列表
checkm2 predict --threads 30 --input <folder_with_bins> --output-directory <output_folder>
checkm2 predict --threads 30 --input ../bin1.fa ../../bin2.fna /some/other/directory/bin3.fasta --output-directory <output_folder>
# 常见问题
## 软件和数据库国内备份
### 国家微生物科学数据中心 —— 数据下载
http://nmdc.cn/datadownload，可以使用Filezilla直接连接 ftp://download.nmdc.cn/tools
本资源由宏基因组平台发起，微生物所提供服务器，宏基因组团队负责维护的常用软件、扩增子和宏基因组数据库的国内下载链接，解决常用数据库下载慢、或无法下载的问题。同时提供定制的软件、数据库索引，节约大家下载时间，节省数据库编制索引的计算资源消耗。
# humann3为例
mkdir -p ~/db/humann3 && cd ~/db/humann3
site=ftp://download.nmdc.cn/tools
wget -c ${site}/humann3/full_chocophlan.v296_201901.tar.gz
wget -c ${site}/humann3/uniref90_annotated_v201901.tar.gz
wget -c ${site}/humann3/full_mapping_v201901.tar.gz
mkdir -p chocophlan uniref utility_mapping
tar xvzf full_chocophlan.v296_201901.tar.gz -C chocophlan/
tar xvzf uniref90_annotated_v201901.tar.gz -C uniref/
tar xvzf full_mapping_v201901.tar.gz -C utility_mapping/
### 百度云备份链接
https://pan.baidu.com/s/1Ikd_47HHODOqC3Rcx6eJ6Q?pwd=0315
下载的tar.gz压缩包，可放置于指定目录，使用`tar -xvzf *.tar.gz`解压
# 大文件的分卷压缩和解压 以kraken2为例
cd ~/db/kraken2
# https://www.cnblogs.com/wang--lei/p/9046643.html
# 文件夹kraken2/打包压缩，1h
tar -zcvf kraken2.tar.gz kraken2/
# b分割为指定大小文件G/M/K，-d数字，a序列长度，输入和输出前缀
split -b 13G -d -a 1 kraken2.tar.gz kraken2.tar.gz.
# 一行命令打包并分割
tar -zcvf kraken2.tar.gz kraken2idx/ | split -b 19G -d -a 1 - kraken2.tar.gz.
# 分割后合并及解压缩
cat kraken2.tar.gz.* | tar -zxv
# 附tar打包用法，c创建、v输出过程，z压缩，f文件 ，x解压
单个文件压缩打包 tar -cvzf my.tar.gz file1
多个文件压缩打包 tar -cvzf my.tar.gz file1 file2 file*
单个目录压缩打包 tar -cvzf my.tar.gz dir1
多个目录压缩打包 tar -cvzf my.tar.gz dir1 dir2
解压缩至当前目录：tar -xvzf my.tar.gz
## kneaddata常见问题
### kneaddata运行提示java版本不支持
# 解决思路，新建虚拟环境，安装kneaddata，再安装对应java版本
# 务必指定2.7，软件依赖2.7的python，但conda会自动安装3.6，运行报错
conda create -n kneaddata python=2.7
conda activate kneaddata
conda install openjdk=8.0.152
conda install kneaddata=0.6.1
### 解压失败-重新下载再安装
tar -xvzf kneaddata.tar.gz -C ~/miniconda3/envs/kneaddata
解压文件提示如下错误
gzip: stdin: invalid compressed data--format violated
tar: Unexpected EOF in archive
tar: Unexpected EOF in archive
tar: Error is not recoverable: exiting now
检查md5值确认文件是否不同
md5sum kneaddata.tar.gz
当前为d26125bee1def1faa99d03a9715bf392
原文件为9fa47a364096b2c33be52a91850b2cde
删除当前文件并重新下载即可
rm kneaddata.tar.gz
wget ftp://download.nmdc.cn/tools//conda/kneaddata.tar.gz
### Lefse在Rstudio中运行命令调用R版本问题的解决
# 在Rstudio中默认调用Rstudio的R，具体写在/etc/rstudio/rserver.conf
# 或在R中用Sys.getenv()["R_HOME"]，在rpy2中print(robjects.r)可以查看其调用的r版本
# 指定lefse调用的R版本，需根据conda实际目录修改
sed -i "2 i os.environ['R_HOME'] = '~/miniconda3/envs/meta/lib/R/'" \
~/miniconda3/envs/meta/share/lefse-1.0.8.post1-1/lefse.py
## Kraken2
### 定制数据库
官方教程详见 https://github.com/DerrickWood/kraken2/blob/master/docs/MANUAL.markdown
本地构建最完整索引，自定义微生物数据库，如标准+真菌+原生动物+质粒+植物
mkdir -p ${db}/kraken2/kraken2_self
conda activate kraken2
# 显示帮助
kraken2-build -h
# 下载物种注释
kraken2-build --download-taxonomy --threads 24 --db ${db}/kraken2/kraken2_self
# 下载数据库，需要12-24小时
for i in archaea bacteria UniVec_Core viral human fungi plasmid protozoa plant; do
kraken2-build --download-library $i --threads 24 --db ${db}/kraken2/kraken2_self
done
# 确定的库建索引，4p,4h
time kraken2-build --build --threads 48 --db ${db}/kraken2/kraken2_self
# bracken索引，长度推荐100/150, 24p, 1h;
time bracken-build -d ./ -t 24 -k 35 -l 100
time bracken-build -d ./ -t 24 -k 35 -l 150
### Perl版本不对
常见问题：Perl版本不对，人工指定perl版本如下
PERL5LIB=~/miniconda3/envs/kraken2/lib/site_perl/5.26.2/x86_64-linux-thread-multi:~/miniconda3/envs/kraken2/lib/site_perl/5.26.2:~/miniconda3/envs/kraken2/lib/5.26.2/x86_64-linux-thread-multi:~/miniconda3/envs/kraken2/lib/5.26.2
## salmon手动安装和使用
# 如不可用，尝试下载二进制和添加环境变量
wget https://github.com/COMBINE-lab/salmon/releases/download/v0.14.0/salmon-0.14.0_linux_x86_64.tar.gz
tar xvzf salmon-0.14.0_linux_x86_64.tar.gz
cp -rf salmon-latest_linux_x86_64/ ${soft}/envs/metagenome_env/share/salmon
# 或者直接使用软件全路径
${soft}/envs/metagenome_env/share/salmon/bin/salmon -v # 0.14.0
## MetaWRAP分箱
### shorten_contig_names.py报错
更新 ${soft}/envs/metawrap/bin/metawrap-scripts/shorten_contig_names.py 脚本
#!/usr/bin/env python2.7
import sys
shorten=False
for line in open(sys.argv[1]):
if line[0]!=">":
print line.rstrip()
else:
if shorten==True:
#print "_".join(line.rstrip().split("_")[:4])
lineL = line.rstrip().split("_")
new_line = '_'.join([lineL[0], lineL[1], lineL[3]])
print new_line[:20]
elif len(line)>20 and len(line.split("_"))>5:
lineL = line.rstrip().split("_")
new_line = '_'.join([lineL[0], lineL[1], lineL[3]])
#print "_".join(line.rstrip().split("_")[:4])
print new_line[:20]
shorten=True
else:
print line.rstrip()
### 绘图plot_binning_results.py报错
更新 ${soft}/envs/metawrap/bin/metawrap-scripts/plot_binning_results.py 脚本
# 原脚本存在嵌套错误，会输出报错，修改部分如下
# Traceback (most recent call last):
# File "/anaconda3/envs/metawrap-env/bin/metawrap-scripts/plot_binning_results.py", line 119, in <module>
# plt.text(x_pos, y_pos, bin_set, fontsize=18, color=c)
# NameError: name 'x_pos' is not defined
# add bin set label to plot
for x_pos,y in enumerate(data[bin_set]):
if y>y_pos:
break
plt.text(x_pos, y_pos, bin_set, fontsize=18, color=c)
y_pos+=y_increment
# add plot and axis titles and adjust the edges
plt.title("Bin contamination ranking", fontsize=26)
plt.xlabel("Acending contamination rank", fontsize=16)
plt.ylabel("Estimated bin contamination (log scale)", fontsize=16)
plt.gcf().subplots_adjust(right=0.9)
# save figure
print "Saving figures binning_results.eps and binning_results.png ..."
plt.tight_layout(w_pad=10)
plt.subplots_adjust(top=0.92, right=0.90, left=0.08)
plt.savefig("binning_results.png",format='png', dpi=300)
plt.savefig("binning_results.eps",format='eps')
#plt.show()
EOF
### blast版本不兼容
更新 metawrap 中的 blast 版本，直接到https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/，下载最新版本blastn，再到conda的metawrap环境bin目录下，替换掉旧版本的blastn
# 如果出现这个错误，BLAST Database error: Error: Not a valid version 4 database.
# 是metawrap 中 blast 版本太老了，需要更新下
wget -c https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ncbi-blast-2.13.0+-x64-linux.tar.gz
tar xvzf ncbi-blast-2.13.0+-x64-linux.tar.gz
mv ncbi-blast-2.13.0+/bin/* ${soft}/envs/metawrap-env/bin/
# 附录
## Conda安装小工具
以下小工具已经整合至EasyMicrobiome项目中的linux文件夹，以下代码提供学习多种自主安装的参考方法，用于积累conda使用
并行计算管理rush/paprllel
# conda安装rush，无依赖关系更好用的并行工具
conda install rush -c bioconda
# Ubuntu下安装方法 apt install parallel
# conda安装parallel，版本有点老
conda install parallel -c bioconda
parallel --version # GNU parallel 20170422
表格统计工具csvtk和序列处理seqkit(可选中)
# 方法1. conda安装，可能有点旧
conda install csvtk -c bioconda
conda install seqkit -c bioconda
# 方法2. 直接下载最新版 https://github.com/shenwei356，如以csvtk为例手动安装
wget -c https://github.com/shenwei356/csvtk/releases/download/v0.22.0/csvtk_linux_amd64.tar.gz
tar xvzf csvtk_linux_amd64.tar.gz
cp csvtk ~/miniconda3/bin/
## 宿主参考基因组下载
- EnsembleGenomes http://ensemblgenomes.org/
- 包括动物、植物、原生生物、真菌、细菌等，此外植物还 Phytozome https://phytozome-next.jgi.doe.gov/ ，以及单个物种和专用数据库
以Ensemble中拟南芥为例：Arabidopsis thaliana -- Genome assembly -- Download DNA sequence (无反应)，点TAIR链接跳转ENA，下载All Seq FASTA
wget https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/api/fasta/GCA_000001735.1?download=true&gzip=true
mv GCA_000001735.1\?download\=true TAIR10.fa
以Ensemble中水稻为例：Oryza sativa Japonica —— IRGSP-1.0
wget https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/api/fasta/GCA_001433935.1?download=true&gzip=true
mv GCA_001433935.1\?download\=true IRGSP1.0.fa
## KEGG层级注释整理
己整合至EasyMicrobiome中，自己更新请访问 https://www.kegg.jp/kegg-bin/show_brite?ko00001.keg 下载htext
# 转换ABCD为列表
kegg_ko00001_htext2tsv.pl -i ko00001.keg -o ko00001.tsv
# 统计行数，2021.1月版55761行，整理后为55103个条目
wc -l ko00001.*
# 统计各级数量, /54/527/23917
for i in `seq 1 2 8`;do
cut -f ${i} ko00001.tsv|sort|uniq|wc -l ; done
# 生成KO编号和注释列表
cut -f 7,8 ko00001.tsv|sort|uniq|sed '1 i KO\tDescription' \
> KO_description.txt
# KO与通路(Pathway)对应表，用于合并D级为C级
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} {print $7,$6}' ko00001.tsv | sed '1 i KO\tpathway' \
> KO_path.list
## 毒力因子数据库VFDB
官网：http://www.mgc.ac.cn/VFs/ 数据每周更新
mkdir -p ${db}/vfdb && cd ${db}/vfdb
# 毒力因子描述文件
wget -c http://www.mgc.ac.cn/VFs/Down/VFs.xls.gz
# 核心数据库(1117K)
wget -c http://www.mgc.ac.cn/VFs/Down/VFDB_setA_pro.fas.gz
# 完整数据库(4.99M)
wget -c http://www.mgc.ac.cn/VFs/Down/VFDB_setB_pro.fas.gz